ब्लॉग के बारे में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए RT-qPCR में महारत हासिल करने के लिए गाइड

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन क्वांटिटेटिव पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (RT-qPCR) संवेदनशील और कुशल आरएनए मात्रात्मककरण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है,दुनिया भर में अनुसंधान प्रयोगशालाओं में जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में क्रांति ला रहा हैयह व्यापक मार्गदर्शिका इस अपरिहार्य प्रौद्योगिकी के मूल सिद्धांतों और व्यावहारिक अनुप्रयोगों की खोज करती है।

आरटी-क्यूपीसीआर आरएनए के पूरक डीएनए (सीडीएनए) में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को मात्रात्मक पीसीआर प्रवर्धन के साथ जोड़ती है।प्रत्येक पीसीआर चक्र के दौरान फ्लोरोसेंस पता लगाने के माध्यम से आरएनए स्तरों की सटीक माप को सक्षम करनाजीन अभिव्यक्ति अध्ययन, रोगजनकों का पता लगाने और रोग अनुसंधान में व्यापक रूप से लागू, यह तकनीक अद्वितीय संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदान करती है।

शोधकर्ताओं को दो प्राथमिक पद्धतियों (चित्र 1, तालिका 1) के बीच निर्णय करना होगा। एक चरण की विधि एक ही ट्यूब में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर प्रवर्धन करती है,जबकि दो चरणों का दृष्टिकोण इन प्रक्रियाओं को प्रत्येक चरण के लिए अनुकूलित परिस्थितियों के साथ अलग प्रतिक्रियाओं में अलग करता है.

जबकि एमआरएनए मामूली उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है, कुल आरएनए आम तौर पर बेहतर मात्रात्मक वसूली और प्रारंभिक कोशिका गणना के लिए बेहतर सामान्यीकरण प्रदान करता है।एमआरएनए संवर्धन चरणों का उन्मूलन अंतर एमआरएनए वसूली दरों से संभावित पूर्वाग्रह को रोकता है, कुल आरएनए को अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए पसंदीदा विकल्प बनाते हैं जहां सापेक्ष मात्रात्मकता सर्वोपरि है।

दो-चरण आरटी-क्यूपीसीआर चार प्राइमर दृष्टिकोण प्रदान करता है (चित्र 2, तालिका 2):

मुख्य एंजाइम विशेषताओं में संरचित आरएनए टेम्पलेट्स के कुशल प्रतिलेखन के लिए थर्मल स्थिरता और उचित आरएनएज़ एच गतिविधि स्तर शामिल हैं।जबकि न्यूनतम आरएनएज़ एच गतिविधि लंबे समय तक ट्रांसक्रिप्ट पीढ़ी को लाभ देती है, मध्यम गतिविधि आरएनए-डीएनए डुप्लेक्स पिघलने की सुविधा के द्वारा qPCR दक्षता को बढ़ाता है आरंभिक पीसीआर चक्रों के दौरान।

इष्टतम क्यूपीसीआर प्राइमर को एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन को कवर करना चाहिए ताकि जीनोमिक डीएनए को दूषित करने के प्रवर्धन को रोक सकें।जीनोमिक डीएनए हस्तक्षेप को समाप्त करने के लिए डीएनएज़ उपचार आवश्यक हो जाता है.

"नो-आरटी" नियंत्रण डीएनए दूषित होने का पता लगाने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस को छोड़कर एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता जांच के रूप में कार्य करता है।इस नियंत्रण में किसी भी प्रवर्धन का संकेत दूषित डीएनए की उपस्थिति है जो प्रयोगात्मक परिणामों से समझौता कर सकता है.

इन तकनीकी मापदंडों पर सावधानीपूर्वक विचार करके, शोधकर्ता विश्वसनीय,पुनरुत्पादक जीन अभिव्यक्ति डेटा जो अध्ययन के विभिन्न क्षेत्रों में वैज्ञानिक समझ को आगे बढ़ाता है.