ब्लॉग के बारे में न्यूक्लिक एसिड निकासी किट के लिए मुख्य सिद्धांत और समस्या निवारण

न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण आणविक जीव विज्ञान प्रयोगों की आधारशिला के रूप में कार्य करता है।कई शोधकर्ता खुद को उलझन में पाते हैं, विशेष रूप से अप्रत्याशित परिणामों का समस्या निवारण करते समय। This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable, कुशल प्रक्रिया।

अधिकांश वाणिज्यिक न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किटों में सिलिका झिल्ली स्पिन कॉलम तकनीक का उपयोग किया जाता है, जिसमें पांच महत्वपूर्ण चरण होते हैंः सेल लिसिस, न्यूक्लिक एसिड बंधन, धोने और शुद्धिकरण, सुखाने,और अंतिम ऊष्मायन. प्रत्येक चरण पिछले एक पर बनाता है, जिसका अर्थ है किसी भी गलत कदम पूरे निष्कर्षण को खतरे में डाल सकता है.

प्रभावी कोशिका विघटन महत्वपूर्ण पहला कदम है। विघटन बफर के रूप में अलग अलग होते हैं, यह निर्भर करता है कि क्या डीएनए या आरएनए निकाला जा रहा है,लेकिन आम तौर पर उच्च सांद्रता वाले कैओट्रॉपिक लवण होते हैं जो दोहरे उद्देश्यों के लिए काम करते हैं:

• प्रोटीन विवर्तन:ये नमक हाइड्रोजन बंधन, वैन डेर वाल्स बल और हाइड्रोफोबिक बातचीत को बाधित करते हैं, न्यूक्लिक एसिड अपघटन को रोकने के लिए प्रोटीन (न्यूक्लियस सहित) को अस्थिर करते हैं।
• सिलिका बंधन को आसान बनाना:चाओट्रोप न्यूक्लिक एसिड से पानी के अणुओं को विस्थापित करते हैं, जिससे सिलिका झिल्ली में स्थानांतरण के लिए इष्टतम परिस्थितियां बनती हैं।

आम कैओट्रोपिक लवण में गुआनिडिन हाइड्रोक्लोराइड, गुआनिडिन थियोसाइनेट, यूरिया और लिथियम पर्क्लोरेट शामिल हैं। प्रोटीन सॉल्यूबिलाइजेशन और सेल लिसिस में सहायता के लिए डिटर्जेंट अक्सर जोड़े जाते हैं।नमूना प्रकार के आधार पर, एंजाइम भी शामिल किए जा सकते हैं। प्रोटीनैस K न्यूक्लिक एसिड तैयारियों में प्रोटीन को प्रभावी ढंग से पचाती है, विशेष रूप से विघटन की स्थिति में। लिसोजाइम एक अन्य आम एंजाइम है,यद्यपि इसकी गतिविधि विवर्तन की परिस्थितियों में घट जाती है.

प्लास्मिड निष्कर्षण आरएनए या जीनोमिक डीएनए अलगाव से काफी भिन्न है। महत्वपूर्ण अंतर पहले प्लास्मिड डीएनए को जीनोमिक डीएनए से अलग करने में निहित है।तुरंत कैोट्रोपिक नमक जोड़ने से सभी डीएनए प्रकार बिना भेदभाव के जारी हो जाएंगेइसलिए, प्लास्मिड प्रोटोकॉल आमतौर पर प्रारंभिक सेल लिसीस के बाद कैट्रोप को पेश करते हैं।

विघटन के अलावा, चाओट्रोपिक नमक सिलिका स्तंभों के लिए न्यूक्लिक एसिड बंधन की सुविधा प्रदान करते हैं। इथेनॉल (या कभी-कभी आइसोप्रोपेनॉल) इस बंधन को बढ़ाता है।सिलिका स्तंभों में राल होती है जो नमक की एकाग्रता और अन्य कारकों के आधार पर डीएनए या आरएनए को चुनिंदा रूप से बांधती हैपरिणामी न्यूक्लिक एसिड क्लोनिंग, लंबी-पढ़ाई अनुक्रमण और अन्य अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त उच्च शुद्धता प्रदर्शित करते हैं।

इथेनॉल की एकाग्रता महत्वपूर्ण साबित होती है। इथेनॉल की अधिकता घटित सामग्री और छोटे अणुओं को अवशोषित करती है, जो ए२६० अवशोषण रीडिंग को प्रभावित करती है।अपर्याप्त इथेनॉल झिल्ली से नमक हटाने में बाधा डाल सकता हैकिट द्वारा प्रदान किए गए इथेनॉल की मात्रा पूर्व-अनुकूलित है, लेकिन यदि बिगड़ता हुआ डीएनए A260 रीडिंग को विकृत करता है, तो इथेनॉल सांद्रता का पुनः अनुकूलन मदद कर सकता है।खोए हुए न्यूक्लिक एसिड को पुनः प्राप्त करने के लिए प्रवाह के माध्यम से समाधानों को वर्षा के लिए बचाया जा सकता हैजब एसडीएस युक्त डिटर्जेंट का प्रयोग लिसीस में किया जाता है, तो एनएसीएल एक प्रभावी अवसादक के रूप में कार्य करता है जो डिटर्जेंट संदूषण से बचता है।

सिलिका झिल्ली के माध्यम से लिसेट को सेंट्रिफ्यूज करने के बाद, लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड स्तंभों से बंधते हैं जबकि प्रोटीन और पॉलीसाकेराइड प्रवाह में रहते हैं।झिल्ली में शेष प्रोटीन और नमक होते हैंपौधों के नमूनों में पॉलीसाखराइड और रंगद्रव्य छोड़ सकते हैं; रक्त के नमूनों में अक्सर भूरे या पीले रंग का परिवर्तन होता है। धोने के चरण इन प्रदूषकों को हटा देते हैं।

दो धोने विशिष्ट हैं, हालांकि सटीक संख्या नमूने के प्रकार पर निर्भर करती है। पहली धोने में आमतौर पर अवशिष्ट प्रोटीन और रंगद्रव्यों को हटाने के लिए कम chaotrope सांद्रता होती है,इसके बाद नमकों को खत्म करने के लिए इथेनॉल धोया जाता हैप्रोटीन में कम मात्रा वाले नमूनों (जैसे प्लास्मिड प्रेप्स या पीसीआर उत्पाद शुद्धिकरण) को केवल इथेनॉल धोने की आवश्यकता हो सकती है। उच्च उपज और शुद्धता के लिए पूर्ण चाओट्रोप हटाने की आवश्यकता साबित होती है।कुछ किट दोहरी इथेनॉल धोने की सलाह देते हैंअवशिष्ट नमक एलुशन को बाधित करते हैं, उपज को कम करते हैं और ए230 रीडिंग को बढ़ाते हैं जो ए260/230 अनुपात को कम करते हैं।

अधिकांश प्रोटोकॉल में स्तंभों से अवशिष्ट इथेनॉल को सूखने के लिए धोने के बाद सेंट्रिफ्यूगेशन शामिल है। यह चरण स्वच्छ एलुएट्स के लिए महत्वपूर्ण साबित होता है।10 एमएम ट्राइस बफर या पानी जोड़कर फिर झिल्ली को मुक्त करने के लिए न्यूक्लिक एसिड को पुनः हाइड्रेट करेंअवशिष्ट इथेनॉल पूर्ण rehydration और elution को रोकता है जबकि इथेनॉल स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है,संकेतों में नमूने शामिल हैं जो अगरोज जेल कुओं में जमा नहीं होते हैं (भले ही लोडिंग डाई मौजूद हो) या -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे रहने में असमर्थता.

अंतिम डीएनए निष्कर्षण चरण में सिलिका से शुद्ध न्यूक्लिक एसिड मुक्त होते हैं। डीएनए के लिए, पीएच 8-9 पर 10 एमएम ट्रिस मानक है।डीएनए कमजोर क्षारीय पीएच में अधिक स्थिर रहता है और पानी की तुलना में बफर में तेजी से घुल जाता है. यहां तक कि डीएनए अवसाद समान रूप से व्यवहार करते हैं। पानी में आमतौर पर निम्न पीएच (4-5) होता है, और उच्च आणविक भार वाले डीएनए को जल्दी से पूरी तरह से पुनर्जलीकृत नहीं किया जा सकता है। अधिकतम डीएनए वसूली के लिए, डीएनए को पुनः प्राप्त करना आवश्यक है।बफर सेंटीफ्यूगेशन से पहले कई मिनट के लिए झिल्ली पर बैठने के लिए. उच्च आणविक भार वाले डीएनए को बरकरार रखने की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों के लिए (उदाहरण के लिए, लंबे समय तक पढ़ने वाले अनुक्रम), एल्यूशन बफर इष्टतम हैं। आरएनए कम अम्लीय पीएच को सहन करता है और पानी में आसानी से घुल जाता है,पानी को पसंदीदा द्रव बनाने के लिए.

यहां तक कि मानक प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, निकासी में विभिन्न समस्याएं हो सकती हैंः

• कम उपज:अक्सर अपूर्ण लिसीस या अपर्याप्त बाध्यकारी परिस्थितियों से उत्पन्न होता है। बफर पतला करने और बाध्यकारी चरणों के लिए हमेशा ताजा, उच्च गुणवत्ता वाले निर्जल इथेनॉल का उपयोग करें।खराब गुणवत्ता या पुराना इथेनॉल नमी को अवशोषित कर सकता हैयाद रखें कि गलत तरीके से तैयार किए गए वॉश बफर निकाले गए न्यूक्लिक एसिड को दूर कर सकते हैं!
• कम शुद्धताःप्रोटीन दूषितता अक्सर अत्यधिक प्रारंभिक सामग्री से होती है जिससे अपूर्ण विघटन का जोखिम बढ़ जाता है। कम A260/230 अनुपात आमतौर पर अवशिष्ट नमक या अपर्याप्त धोने का संकेत देते हैं।वाश बफर के लिए उच्चतम गुणवत्ता वाले इथेनॉल का प्रयोग करें, और यदि समस्याएं बनी रहती हैं, तो अतिरिक्त धोने के चरण जोड़ें।
• दूषित पदार्थ:पर्यावरण के नमूने विशेष रूप से ह्यूमिक पदार्थों के प्रति संवेदनशील होते हैं जो डीएनए के साथ सह-शुद्ध करते हैं और सिलिका स्तंभ को हटाने का विरोध करते हैं।विशेष तकनीकें स्तंभ बंधने से पहले हस्तक्षेपकारी प्रोटीन और ह्यूमिक्स को हटा सकती हैं.
• क्षरणःआरएनए को अपर्याप्त नमूना भंडारण या अक्षम लिसीस से अधिक जोखिम का सामना करना पड़ता है (यह मानते हुए कि आरएनएज़ मुक्त पानी का उपयोग किया जाता है) । डीएनए के लिए,क्षरण पीसीआर अनुप्रयोगों के लिए कम मायने रखता है लेकिन लंबे समय तक पढ़ने वाले अनुक्रमण के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है जिसके लिए बरकरार उच्च आणविक भार डीएनए की आवश्यकता होती है!
• पीसीआर उत्पाद शुद्धिकरण:हालांकि यह सख्ती से डीएनए निष्कर्षण नहीं है, यह उल्लेख करने योग्य है। आमतौर पर, स्पिन स्तंभ शुद्धिकरण से पहले पीसीआर प्रतिक्रिया मात्रा के अनुसार 3-5 मात्रा में नमक समाधान जोड़ा जाता है।असफल शुद्धिकरण आमतौर पर विफल पीसीआर से उत्पन्न होते हैं, लेकिन प्रवाह को बचाना बुद्धिमानी की बात है यदि पारदर्शी पीसीआर बैंड कॉलम को नहीं बांधते हैं, तो वे संभवतः वसूली और पुनः शुद्धिकरण के लिए प्रवाह में बने रहेंगे।

अपूर्ण लिसीस अप्रत्याशित रूप से कम उपज, अपूर्ण प्रोटीन विघटन, या खराब A260/230 अनुपात के रूप में प्रकट हो सकता है।इनसे पता चलता है कि कुछ नमूना घटक निष्कर्षण के दौरान पूरी तरह से लिज़ या भंग करने में विफल रहे।अपूर्ण लिसीस को दूषित या अपघटन से अलग करने के लिए लिसीस बफर की संरचना, ऊष्मायन मापदंडों सहित निष्कर्षण स्थितियों का सावधानीपूर्वक विश्लेषण करना आवश्यक है।और संभावित हस्तक्षेप करने वाले पदार्थउदाहरण के लिए, खराब A260/230 अनुपात अपूर्ण लिसीस के बजाय शेष नमक के बाद बंधन या अपर्याप्त धोने का संकेत दे सकते हैं।अपूर्ण लिसीस को संबोधित करने के लिए लिसीस बफर घटकों को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है, इनक्यूबेशन समय, या अतिरिक्त यांत्रिक/एंजाइमेटिक लिसीस विधियों को शामिल करना।

विशेष तकनीक पर्यावरण के नमूनों से ह्यूमिक पदार्थों और अन्य हस्तक्षेपों को हटाने का लक्ष्य रखती है जो न्यूक्लिक एसिड के साथ सह-शुद्ध कर सकते हैं।इनमें विशेष निष्कर्षण बफर शामिल हैं जिनमें केलेटिंग एजेंट होते हैं (eउदाहरण के लिए, ईडीटीए) को चुनिंदा रूप से बांधने और कटियनों को हटाने के लिए।अंतर केन्द्रापसार या निस्पंदन जैसे पूर्व उपचार विधियां न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण से पहले पर्यावरणीय नमूनों से बड़े कण पदार्थों को हटाने में मदद कर सकती हैं, बंधन चरणों के दौरान हस्तक्षेप को कम करता है।

कुछ नमूनों (जैसे, ऊतकों या लिपिड युक्त सामग्री) में विशिष्ट चुनौतियां होती हैं।ऊतक नमूनों को अक्सर पूर्ण लिसीस और न्यूक्लिक एसिड रिलीज़ सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त यांत्रिक व्यवधान या एंजाइमेटिक पाचन की आवश्यकता होती है. लिपिड युक्त नमूनों से शुद्धिकरण जटिल हो सकता है क्योंकि लिपिड कॉलम मैट्रिक्स के लिए न्यूक्लिक एसिड बंधन में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए लिसीस बफर संरचना को संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है,शुद्धिकरण प्रोटोकॉल का अनुकूलन, या विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए किट का उपयोग करके।

मूल रूप से 28 जून, 2010 को प्रकाशित किया गया। मई 2021 और मार्च 2024 में समीक्षा और पुनः प्रकाशित किया गया।