आरटीपीसीआर परीक्षण सिद्धांत व्याख्या और कोविड19 जोखिम

चूंकि COVID-19 महामारी वैश्विक चुनौतियां पेश करना जारी रखती है, RT-PCR (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन) परीक्षण SARS-CoV-2 संक्रमण का निदान करने के लिए स्वर्ण मानक बना हुआ है। लेकिन कितने लोग इस महत्वपूर्ण नैदानिक ​​उपकरण के पीछे के वैज्ञानिक सिद्धांतों को वास्तव में समझते हैं? यह लेख RT-PCR परीक्षण की गहन लेकिन सुलभ व्याख्या प्रदान करता है, जो चिकित्सा पेशेवरों और आम जनता दोनों को इस महत्वपूर्ण तकनीक को बेहतर ढंग से समझने में मदद करता है।

RT-PCR, या रियल-टाइम रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन, एक अत्यधिक संवेदनशील और तेज़ आणविक जीव विज्ञान तकनीक है जिसका उपयोग नमूनों में विशिष्ट आनुवंशिक सामग्री का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह आनुवंशिक सामग्री मनुष्यों, बैक्टीरिया या SARS-CoV-2 जैसे वायरस से उत्पन्न हो सकती है।

RT-PCR के पीछे की मुख्य तकनीक PCR है, जिसका आविष्कार 1980 के दशक में कैरी बी. मुलिस ने किया था (जिसके लिए उन्हें नोबेल पुरस्कार मिला)। PCR विशिष्ट DNA लक्ष्यों को बढ़ाता और पता लगाता है। बाद में सुधारों ने प्रवर्धन के दौरान DNA लक्ष्यों के "वास्तविक समय" दृश्य और मात्रात्मकता को सक्षम किया। रियल-टाइम PCR में, विशेष जांच से फ्लोरोसेंस तीव्रता, प्रवर्धित DNA की मात्रा के साथ सहसंबद्ध होती है।

हालांकि, मानक PCR केवल DNA का पता लगाता है। चूंकि SARS-CoV-2 में RNA आनुवंशिक सामग्री होती है, इसलिए परीक्षण के लिए RNA को पूरक DNA (cDNA) में बदलने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ एंजाइम की आवश्यकता होती है। यह रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण, रियल-टाइम PCR के साथ मिलकर, RT-PCR को SARS-CoV-2 जैसे RNA वायरस का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाता है।

RT-PCR को समझने के लिए आनुवंशिक सामग्री की बुनियादी जानकारी की आवश्यकता होती है—निर्देश पुस्तिका जो कोशिकीय और वायरल व्यवहार, अस्तित्व और प्रजनन को नियंत्रित करती है। आनुवंशिक सामग्री दो प्राथमिक रूपों में आती है: DNA (डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड) और RNA (राइबोन्यूक्लिक एसिड)। DNA में डबल-स्ट्रैंडेड संरचना होती है जबकि RNA सिंगल-स्ट्रैंडेड होता है। नैदानिक ​​उद्देश्यों के लिए, DNA की अधिक स्थिरता इसे संक्रामक रोग परीक्षण के लिए बेहतर बनाती है। विशेष रूप से, SARS-CoV-2 में केवल RNA होता है।

सभी वायरस अस्तित्व और प्रतिकृति के लिए मेजबान कोशिकाओं पर निर्भर रहने की विशेषता साझा करते हैं। SARS-CoV-2, अन्य वायरसों की तरह, प्रजनन के लिए स्वस्थ कोशिकाओं पर आक्रमण करता है। जब संक्रमण होता है, तो वायरस अपने RNA को छोड़ता है और प्रतिकृति के लिए सेलुलर मशीनरी को हाईजैक कर लेता है। जब तक वायरल आनुवंशिक सामग्री कोशिकाओं में रहती है, RT-PCR SARS-CoV-2 संक्रमण का पता लगा सकता है।

प्रशिक्षित स्वास्थ्यकर्मी नासोफैरेंजियल स्वाब नमूने एकत्र करते हैं, जिन्हें बाद में वायरल अखंडता को संरक्षित करने के लिए वायरल परिवहन माध्यम युक्त बाँझ ट्यूबों में रखा जाता है।

प्रयोगशाला में, शोधकर्ता वाणिज्यिक शुद्धिकरण किट का उपयोग करके RNA निकालते हैं। फिर RNA नमूने को परीक्षण के लिए आवश्यक सभी घटकों वाले एक प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ा जाता है, जिसमें DNA पोलीमरेज़, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़, DNA बिल्डिंग ब्लॉक और SARS-CoV-2-विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच और प्राइमर शामिल हैं।

चूंकि PCR केवल DNA टेम्पलेट्स के साथ काम करता है, इसलिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ नमूने में मौजूद सभी RNA (मानव, बैक्टीरियल, अन्य कोरोनावायरस RNA और संभावित रूप से SARS-CoV-2 RNA सहित) को cDNA में बदल देता है।

इस प्रक्रिया में तीन दोहराए जाने वाले चरण शामिल हैं:

• विकृतीकरण: लगभग 10 मिनट के लिए >90 डिग्री सेल्सियस पर DNA को गर्म करने से डबल-स्ट्रैंडेड DNA सिंगल स्ट्रैंड में अलग हो जाता है।
• प्राइमर एनीलिंग: विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए छोटे DNA टुकड़े (प्राइमर) कम तापमान पर विशिष्ट SARS-CoV-2 cDNA लक्ष्यों से जुड़ जाते हैं। सामान्य COVID-19 जीन लक्ष्यों में RNA-निर्भर RNA पोलीमरेज़ (RdRP), ORF1ab, S जीन (स्पाइक प्रोटीन), N जीन (न्यूक्लियोकैप्सिड) और E जीन (एन्वेलेप) शामिल हैं।
• विस्तार: DNA पोलीमरेज़ प्राइमर का उपयोग लक्ष्य DNA खंडों की समान प्रतियां बनाने के लिए शुरुआती बिंदुओं के रूप में करता है।

प्रक्रिया आमतौर पर 40 बार दोहराई जाती है, प्रत्येक चक्र के साथ लक्ष्य DNA को दोगुना किया जाता है। फ्लोरोसेंट जांच प्राइमर के नीचे बंध जाती है, प्रत्येक DNA प्रवर्धन के साथ पता लगाने योग्य संकेत जारी करती है। लक्ष्य DNA में वृद्धि फ्लोरोसेंस तीव्रता के बढ़ने के साथ सहसंबद्ध होती है।

फ्लोरोसेंस डेटा एक "चक्र सीमा" (Ct) मान उत्पन्न करता है—सिग्नल को पृष्ठभूमि के स्तर से अधिक होने के लिए आवश्यक चक्रों की संख्या। अधिक लक्ष्य DNA वाले नमूने तेजी से प्रवर्धित होते हैं, जिसके लिए कम चक्रों (कम Ct मान) की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, दुर्लभ लक्ष्य DNA के लिए अधिक चक्रों (उच्च Ct मान) की आवश्यकता होती है।

Ct मान वायरल लोड के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं। कम Ct मान उच्च वायरल जीनोम मात्रा को इंगित करते हैं, जबकि उच्च मान कम मात्रा का सुझाव देते हैं। स्वास्थ्य सेवा प्रदाता रोग के चरण का आकलन करने के लिए Ct मानों को नैदानिक ​​लक्षणों और इतिहास के साथ जोड़ते हैं। बार-बार परीक्षण से सीरियल Ct मान रोग की प्रगति की निगरानी करने और ठीक होने की भविष्यवाणी करने में मदद करते हैं। संपर्क अनुरेखक भी उच्चतम वायरल लोड वाले रोगियों (और इस प्रकार सबसे अधिक संचरण जोखिम) को प्राथमिकता देने के लिए Ct मानों का उपयोग करते हैं।

• वायरल लोड: Ct मान वायरल लोड के साथ विपरीत रूप से सहसंबद्ध होते हैं—कम Ct का अर्थ है अधिक वायरस मौजूद है।
• रोग का चरण: प्रारंभिक संक्रमण आमतौर पर उच्च वायरल लोड (कम Ct) दिखाता है, जबकि बाद के चरणों में संक्रमण से मुक्त होने पर लोड कम होता जाता है (बढ़ता Ct)।
• संचरण जोखिम: उच्च वायरल लोड (कम Ct मान) अधिक संचरण क्षमता का संकेत देते हैं, जिससे सख्त अलगाव उपायों की आवश्यकता होती है।

COVID-19 के नैदानिक ​​स्वर्ण मानक होने के बावजूद, RT-PCR की सीमाएँ हैं:

• गलत नकारात्मक: अनुचित नमूनाकरण, कम वायरल लोड, या प्रारंभिक परीक्षण वास्तविक संक्रमण के बावजूद नकारात्मक परिणाम दे सकते हैं।
• गलत सकारात्मक: वास्तविक संक्रमण के बिना दुर्लभ लेकिन संभावित सकारात्मक परिणाम।
• मानकीकरण चुनौतियाँ: विभिन्न प्रयोगशालाएँ और प्लेटफ़ॉर्म अलग-अलग Ct थ्रेसहोल्ड का उपयोग कर सकते हैं, जिससे तुलनाएँ जटिल हो जाती हैं।

SARS-CoV-2 आनुवंशिक सामग्री का पता लगाकर COVID-19 निदान के लिए RT-PCR परीक्षण आवश्यक बना हुआ है। Ct मान वायरल लोड, रोग की प्रगति और संचरण जोखिम के महत्वपूर्ण संकेतक के रूप में कार्य करते हैं। हालांकि, परीक्षण सीमाओं के लिए सटीक निदान और प्रबंधन के लिए नैदानिक ​​मूल्यांकन के साथ परिणामों को जोड़ना आवश्यक है।